Nature：重大突破！無需病毒載體，利用電穿孔成功對人T細胞進行CRISPR基因編輯
在一項新的研究中，來自美國加州大學舊金山分校的研究人員在不使用病毒插入DNA的情形下對人T細胞（一種免疫細胞）進行重編程。這一成就對研究、醫學和產業產生重大的影響。他們期待他們的方法---一種快速的通用的經濟的采用CRISPR基因編輯技術的方法---將會在新興的細胞治療領域中得到廣泛使用，加速開發出新的更加安全的治療癌癥、自身免疫疾病和其他疾?。òê币姷?/span>遺傳性疾?。┑寞煼āＯ嚓P研究結果于2018年7月11日在線發表在Nature期刊上，論文標題為“Reprogramming human T cell function and specificity with non-viral genome targeting”。
這種新方法提供了一種強大的分子“剪切和粘貼”系統，用于重寫人T細胞中的基因組序列。它依賴于電穿孔，即一種將電場施加到細胞上使得它們的細胞膜暫時地更具有滲透性。在一年內試驗了數千個變量之后，這些研究人員發現，當某些數量的T細胞、DNA和CRISPR“剪刀”混合在一起然后暴露在一種適當的電場中時，這些T細胞將攝入DNA和CRISPR剪刀，并且精確地將特定的基因序列整合到CRISPR在基因組中的靶切割位點上。
論文通信作者、加州大學舊金山分校微生物學與免疫學副教授Alex Marson博士說，“這是一種快速而又靈活的方法，可用于改變、強化和重編程T細胞，這樣我們就能夠給它們提供我們想要的特異性來清除癌癥、識別感染或者抑制自身免疫性疾病中觀察到的過度免疫反應。”
Marson說，不過與這種新方法的速度和易用性同樣重要的是它使得將比較長的DNA序列插入到T細胞中成為可能，這種插入會給這些T細胞賦予強大的新特性。Marson實驗室的成員已在利用電穿孔和CRISPR將短DNA片段插入到T細胞中取得了一些成功，但是，在此之前，許多科學家們將較長的DNA序列插入到T細胞中的多次嘗試導致這些T細胞死亡，這就讓大多數人認為較長的DNA序列對T細胞是極其有毒性的。
為了證實這種新方法的多功能性和功效，這些研究人員利用它修復來自三名患有一種罕見遺傳形式的自身免疫疾病的兒童的T細胞中的引起疾病的基因突變，并且還利用它構建出定制的T細胞來尋找和殺死人黑色素瘤細胞。
病毒通過將它們自己的遺傳物質注射到細胞中而引起感染，而且自20世紀70年代以來，科學家們借鑒病毒的這種能力，除去它們的傳染性，由此產生的“病毒載體”可將DNA轉運到細胞中用于研究和基因治療，并且構建CAR-T細胞用于癌癥免疫療法。
如今，利用病毒對T細胞進行基因改造已被美國食品藥物管理局（FDA）批準用于抵抗某些類型的白血病和淋巴瘤。但是構建病毒載體是一個艱苦而成本昂貴的過程，而且臨床級病毒載體的短缺導致基因療法和基于細胞的療法陷入制造瓶頸。即使在可用的情況下，病毒載體也是很不理想的，這是因為它們將基因隨意地插入到細胞基因組中，這可能損害現有的健康基因或讓新導入的基因不受確保細胞發揮正常功能的調節機制的調節。這些限制可能潛在地導致嚴重的副作用，因而在基因療法和細胞療法（比如基于CAR-T細胞的免疫療法）中引發人們的擔憂。
論文第一作者、在加州大學舊金山分校醫學科學家培訓計劃攻讀博士學位的研究生Theo Roth說，“已有30多年的研究工作試圖將新的基因導入到T細胞中。如今，應當不再需要實驗室中的六到七個人利用病毒對T細胞進行基因改造，而且如果我們開始看到數百個實驗室而不是少數實驗室對這些T細胞進行基因改造，并研究越來越復雜的DNA序列，那么我們將嘗試更多的可能性以便顯著加快未來幾代細胞療法的開發?！?/span>
經過將近一年的反復試驗，Roth確定了T細胞群體、DNA量和CRISPR豐度的比例，并且在施加具有適當參數的電場的情形下，能夠高效而又準確地編輯T細胞的基因組。
為了驗證這些發現，Roth利用CRISPR給一系列不同的T細胞蛋白標記上綠色熒光蛋白（GFP），這種標記結果是高度特異性的，具有非常低水平的“脫靶”效應：僅通過Roth設計出的CRISPR模板而被標記上GFP的每個亞細胞結構才會在顯微鏡下發出綠色熒光。
隨后，在旨在對這種新方法的治療前景進行概念驗證的補充實驗中，Roth、Marson及其同事展示了它如何潛在地被用來引導T細胞抵抗自身免疫疾病或癌癥。
在第一組補充實驗中，Roth及其同事們使用了美國耶魯大學醫學院醫學博士Kevan Herold提供給Marson實驗室的T細胞。這些T細胞來自三名患有罕見的嚴重性自身免疫疾病而且迄今為止一直對治療產生抵抗力的兄弟姐妹?；蚪M測序已表明這三名兒童的T細胞在IL2RA基因上攜帶著突變。這個基因含有表達一個細胞表面受體的指令。這個細胞表面受體是控制其他的免疫細胞和阻止自身免疫反應的調節性T細胞產生所必需的。
利用這種非病毒CRISPR技術，這些研究人員能夠快速地修復這三名兒童T細胞中的IL2RA突變，并恢復受到這種突變影響的細胞信號。在CAR-T細胞免疫治療中，已從患者體內取出的T細胞經過基因改造后能夠增強它們的抗癌能力，隨后將它們灌注回患者體內，從而靶向攻擊腫瘤。這些研究人員希望一種類似的方法也可能有效地治療調節性T細胞發生功能故障的自身免疫疾病，比如這三名攜帶著IL2RA突變的兒童所患的疾病。
在第二組補充實驗中，通過與加州大學洛杉磯分校帕克癌癥免疫療法研究所的Cristina Puig-Saus博士和Antoni Ribas博士合作，Marson團隊利用已經過特異性地基因改造靶向摧毀一種特定的人黑色素瘤細胞亞型的新型T細胞受體完全取代一種正常的人T細胞群體攜帶的天然T細胞受體。T細胞受體是T細胞用來檢測疾病或感染的傳感器，并且在實驗室培養皿中，這些經過基因改造的T細胞高效地靶向黑色素瘤細胞并且同時忽略其他的細胞，從而表現出精確癌癥醫學所需的靶向特異性。
在不使用病毒的情況下，這些研究人員能夠產生大量的經過CRISPR重編程的T細胞，這些T細胞經重編程后產生新的T細胞受體。當被移植到已植入人黑素色瘤的小鼠中時，這些經過CRISPR重編程的人T細胞進入腫瘤部位并顯示出抗癌活性。
Marson 說，“這種替換T細胞受體的策略能夠推廣到任何一種T細胞受體。通過這種新技術，我們能夠對基因組的特定位點進行分子剪切和粘貼，從而重寫基因組序列中的特定片段?！?/span>
Roth說，鑒于這種新技術能夠在一周多一點的時間內構建出可行的定制T細胞系，它已改變了Marson實驗室的研究環境。針對之前因病毒載體帶來的障礙而被認為過于困難或昂貴的實驗的想法如今能夠加以研究。Roth說，“我們將研究20個'瘋狂'的想法，這是因為我們能夠非?？焖俚貏摻–RISPR模板，而且一旦我們有了模板，我們就能夠將它放入T細胞中并快速地培養這些T細胞?！?/span>
在面對人們普遍認為病毒載體是必需的以及T細胞僅耐受小片段DNA的情形下，Marson將這種新方法的成功歸功于Roth的“絕對堅持”?！癛oth確信如果我們能夠找到合適的條件，我們就能夠克服這些明顯的限制，而且他付出了巨大的努力來測試數千種不同的條件：CRISPR與DNA的比例；不同的T細胞培養方法；不同的電流。通過優化每個參數并將最佳條件放在一起，他能夠觀察到這個令人吃驚的結果。”（生物谷 Bioon.com）
參考資料：
Theodore L. Roth, Cristina Puig-Saus, Ruby Yu et al. Reprogramming human T cell function and specificity with non-viral genome targeting. Nature, Published online: 11 July 2018, doi:10.1038/s41586-018-0326-5
圖片來自Meletios Verras/iStock。
論文通信作者、加州大學舊金山分校微生物學與免疫學副教授Alex Marson博士說，“這是一種快速而又靈活的方法，可用于改變、強化和重編程T細胞，這樣我們就能夠給它們提供我們想要的特異性來清除癌癥、識別感染或者抑制自身免疫性疾病中觀察到的過度免疫反應。”
Marson說，不過與這種新方法的速度和易用性同樣重要的是它使得將比較長的DNA序列插入到T細胞中成為可能，這種插入會給這些T細胞賦予強大的新特性。Marson實驗室的成員已在利用電穿孔和CRISPR將短DNA片段插入到T細胞中取得了一些成功，但是，在此之前，許多科學家們將較長的DNA序列插入到T細胞中的多次嘗試導致這些T細胞死亡，這就讓大多數人認為較長的DNA序列對T細胞是極其有毒性的。
為了證實這種新方法的多功能性和功效，這些研究人員利用它修復來自三名患有一種罕見遺傳形式的自身免疫疾病的兒童的T細胞中的引起疾病的基因突變，并且還利用它構建出定制的T細胞來尋找和殺死人黑色素瘤細胞。
病毒通過將它們自己的遺傳物質注射到細胞中而引起感染，而且自20世紀70年代以來，科學家們借鑒病毒的這種能力，除去它們的傳染性，由此產生的“病毒載體”可將DNA轉運到細胞中用于研究和基因治療，并且構建CAR-T細胞用于癌癥免疫療法。
如今，利用病毒對T細胞進行基因改造已被美國食品藥物管理局（FDA）批準用于抵抗某些類型的白血病和淋巴瘤。但是構建病毒載體是一個艱苦而成本昂貴的過程，而且臨床級病毒載體的短缺導致基因療法和基于細胞的療法陷入制造瓶頸。即使在可用的情況下，病毒載體也是很不理想的，這是因為它們將基因隨意地插入到細胞基因組中，這可能損害現有的健康基因或讓新導入的基因不受確保細胞發揮正常功能的調節機制的調節。這些限制可能潛在地導致嚴重的副作用，因而在基因療法和細胞療法（比如基于CAR-T細胞的免疫療法）中引發人們的擔憂。
論文第一作者、在加州大學舊金山分校醫學科學家培訓計劃攻讀博士學位的研究生Theo Roth說，“已有30多年的研究工作試圖將新的基因導入到T細胞中。如今，應當不再需要實驗室中的六到七個人利用病毒對T細胞進行基因改造，而且如果我們開始看到數百個實驗室而不是少數實驗室對這些T細胞進行基因改造，并研究越來越復雜的DNA序列，那么我們將嘗試更多的可能性以便顯著加快未來幾代細胞療法的開發?！?/span>
經過將近一年的反復試驗，Roth確定了T細胞群體、DNA量和CRISPR豐度的比例，并且在施加具有適當參數的電場的情形下，能夠高效而又準確地編輯T細胞的基因組。
為了驗證這些發現，Roth利用CRISPR給一系列不同的T細胞蛋白標記上綠色熒光蛋白（GFP），這種標記結果是高度特異性的，具有非常低水平的“脫靶”效應：僅通過Roth設計出的CRISPR模板而被標記上GFP的每個亞細胞結構才會在顯微鏡下發出綠色熒光。
隨后，在旨在對這種新方法的治療前景進行概念驗證的補充實驗中，Roth、Marson及其同事展示了它如何潛在地被用來引導T細胞抵抗自身免疫疾病或癌癥。
在第一組補充實驗中，Roth及其同事們使用了美國耶魯大學醫學院醫學博士Kevan Herold提供給Marson實驗室的T細胞。這些T細胞來自三名患有罕見的嚴重性自身免疫疾病而且迄今為止一直對治療產生抵抗力的兄弟姐妹?；蚪M測序已表明這三名兒童的T細胞在IL2RA基因上攜帶著突變。這個基因含有表達一個細胞表面受體的指令。這個細胞表面受體是控制其他的免疫細胞和阻止自身免疫反應的調節性T細胞產生所必需的。
利用這種非病毒CRISPR技術，這些研究人員能夠快速地修復這三名兒童T細胞中的IL2RA突變，并恢復受到這種突變影響的細胞信號。在CAR-T細胞免疫治療中，已從患者體內取出的T細胞經過基因改造后能夠增強它們的抗癌能力，隨后將它們灌注回患者體內，從而靶向攻擊腫瘤。這些研究人員希望一種類似的方法也可能有效地治療調節性T細胞發生功能故障的自身免疫疾病，比如這三名攜帶著IL2RA突變的兒童所患的疾病。
在第二組補充實驗中，通過與加州大學洛杉磯分校帕克癌癥免疫療法研究所的Cristina Puig-Saus博士和Antoni Ribas博士合作，Marson團隊利用已經過特異性地基因改造靶向摧毀一種特定的人黑色素瘤細胞亞型的新型T細胞受體完全取代一種正常的人T細胞群體攜帶的天然T細胞受體。T細胞受體是T細胞用來檢測疾病或感染的傳感器，并且在實驗室培養皿中，這些經過基因改造的T細胞高效地靶向黑色素瘤細胞并且同時忽略其他的細胞，從而表現出精確癌癥醫學所需的靶向特異性。
在不使用病毒的情況下，這些研究人員能夠產生大量的經過CRISPR重編程的T細胞，這些T細胞經重編程后產生新的T細胞受體。當被移植到已植入人黑素色瘤的小鼠中時，這些經過CRISPR重編程的人T細胞進入腫瘤部位并顯示出抗癌活性。
Marson 說，“這種替換T細胞受體的策略能夠推廣到任何一種T細胞受體。通過這種新技術，我們能夠對基因組的特定位點進行分子剪切和粘貼，從而重寫基因組序列中的特定片段?！?/span>
Roth說，鑒于這種新技術能夠在一周多一點的時間內構建出可行的定制T細胞系，它已改變了Marson實驗室的研究環境。針對之前因病毒載體帶來的障礙而被認為過于困難或昂貴的實驗的想法如今能夠加以研究。Roth說，“我們將研究20個'瘋狂'的想法，這是因為我們能夠非?？焖俚貏摻–RISPR模板，而且一旦我們有了模板，我們就能夠將它放入T細胞中并快速地培養這些T細胞?！?/span>
在面對人們普遍認為病毒載體是必需的以及T細胞僅耐受小片段DNA的情形下，Marson將這種新方法的成功歸功于Roth的“絕對堅持”?！癛oth確信如果我們能夠找到合適的條件，我們就能夠克服這些明顯的限制，而且他付出了巨大的努力來測試數千種不同的條件：CRISPR與DNA的比例；不同的T細胞培養方法；不同的電流。通過優化每個參數并將最佳條件放在一起，他能夠觀察到這個令人吃驚的結果。”（生物谷 Bioon.com）
參考資料：
Theodore L. Roth, Cristina Puig-Saus, Ruby Yu et al. Reprogramming human T cell function and specificity with non-viral genome targeting. Nature, Published online: 11 July 2018, doi:10.1038/s41586-018-0326-5